|
WAŻNE ARTYKUŁY
AKADEMIA MEDYCZNA WARSZAWA
WYDZIAŁ FARMACJI ZAKŁAD CHEMII FIZYCZNEJ
02-057 Warszawa, ul. Banacha 1
BADANIE ANTYUTLENIAJĄCYCH
WŁAŚCIWOŚCI BIOLOGICZNIE AKTYWNYCH
DODATKÓW DO ŻYWNOŚCI
M. Wasek, L.M. Krześniak, I. Wawer
BADANIE ANTYUTLENIAJĄCYCH WŁAŚCIWOŚCI
BIOLOGICZNIE AKTYWNYCH DODATKÓW DO ŻYWNOŚCI
M. Wasek, L.M. Krześniak, L Wawer
Wydział Farmaceutyczny, Akademia Medyczna w Warszawie,
Zakład Chemii Fizycznej
02-057 Warszawa, ul Banacha 1
WSTĘP
Jeszcze Kilkadziesiąt lat temu, tlen był uważany
wyłącznie za pierwiastek niezbędny do życia. Nikt nie
przypuszczał, że w stężeniu większym niż występuje w
warunkach naturalnych, niektóre jego formy mogą być
czynnikiem niszczącym życie. Odkrycie toksyczności tlenu
było związane z wykryciem w zdrowych organizmach wolnych
rodników tlenowych (WRT). Powodują one uszkodzenia komórek i
są szczególnie niebezpieczne dla jądra komórkowego i
mitochondriów. Jest wiele prac udowadniających, że
rak, arterioskleroza, choroba Alzheimera czy Parkinsona są
związane z malejącą odpornością na działanie rodników w
komórkach. Antyoksydanty (przeciwutleniacze) eliminują wolne
rodniki. Bardzo ważne jest więc stosowanie diety bogatej
w antyutleniacze takie jak witamina C i E, karoteny, a
również związki typu polifenoli [1,2,3]. Związki
polifenolowe takie jak: flawonoidy, antocyjany czy taniny
wykazują właściwości antyutleniające, neutralizują
powstające w tkankach wolne rodniki. Surowce lecznicze
zawierające polifenole są często głównym składnikiem wielu
mieszanek ziołowych, herbat ziołowych oraz preparatów
leczniczych naturalnego pochodzenia, które spełniają rolę
aktywnych biologicznie dodatków do żywności. Celem pracy
było zbadanie efektywności działania różnych antyutleniaczy
z grupy biologicznie aktywnych dodatków do żywności.
BADANE MATERIAŁY
Do badania antyutleniających właściwości wybrano
następujące, biologicznie aktywne, dodatki do żywności firmy
Arkopharma (Francja): Antiox, Lifepack Multiwitamina,
Lifepack Antiox, Lifepack Multimineral, Lifepack Junior,
Detox, Chromvital, Sveltform, Detox + Selen, Pax, Nutrimax,
Millenium-żel. Grupę kontrolną stanowiły następujące
preparaty biologicznie aktywne: Rose-ox (Herbalife),
Nutrilite Daily (Nutrilite A Division of Amway Corp., USA),
Citrosept (Cintmanti International AS, Norwegia),
Centrum Silver (Wyeth-Ayerst, Canada), Bilobil (KRKA, d.d.,
Slovenia),
Vilcacora (Andean Medicine Centre, London, Wielka Brytania).
Dodatkowo w celu porównawczym do badanych materiałów
dołączono preparaty powszechnie dostępne i uważane za bardzo
silne antyoxydanty: zielona herbata, zmielone i wysuszone
nasiona winogron oraz tabletki French Paradox.
SKŁAD WYBRANYCH MATERIAŁÓW FIRMY ARKOPHARMA
Do badania wybrano nie tylko uznawane za wymiatacze wolnych
rodników, lecz także o innym przeznaczeniu terapeutycznym
(np. Pax, Nutrimax, Millenium-żel). Składd wybranych
materiałów firmy Arkopharma przeznaczonych do badań
przedstawiono w tabeli 1.
IDEA METODY
Żelatynowe kapsułki po 390 mg:
Wyciąg wytłoków winogron (150); Miłorząb dwuklapowy – Ginkgo
biloba (26,5); Witamina C (65); Witamina E (10);
Beta-karoten (5); Drożdże z selenem (50) – odpowiada
zawartości 50 µg selenu; Tlenek cynku (18,5) -
odpowiada zawartości 15 mg cynku. Uncaria tomentosa –
żelatynowe kapsułki po 38,5 mg: Uncaria tomentosa (380).
Bezbarwna przezroczysta kapsułka z proszkiem o barwie żółtej
z szarym odcieniem (450mg): Witamina C (66); Witamina PP
(18); Witamina E - octan tokoferolu (10); Witamina B5 (6);
Beta-karoten (2,5); Witamina B6 (1,65); Witamina B2 (1,6):
Witamina B5 (1,15); Witamina B9 (0,2); Witamina H (0,15);
Witamina D3 (5 µg); Witamina B12 (1 µg). Żelatynowe kapsułki
po 410 mg: Cierniopląt guarana - Osmęta – Paullinia Cupana
(72); Spirulina – Spirulina maxima (75); Kolcosił –
Eleutherococcus senticosus (175); Kola – Cola niti-da (20);
Drożdże z chromem (25) – odpowiada zawartości 50 µg chromu;
Witamina C (33). Tabletki po 740 mg: Witamina C (12,5);
Witamina PP (3); Witamina E (2,5); Beta-karoten (0,75);
Witamina B6 (0,325); Witamina B2 (0.325); Witamina B1
(0.25); Witamina B9 (0,03); Witamina B12 (0,5 µg); Witamina
D3 (0,25) – odpowiada zawartości 25j cholecalciferolu;
Fosforan wapnia (22) – odpowiada zawartości 5,0 mg wapnia i
4,0 mg fosforu; Trójfosforan sodu (4) – odpowiada zawartości
1,0 mg fosforu; Siarczan miedzi (0,23) – odpowiada
zawartości 50 µg miedzi; Ortofosforan chromu (13,5µg) –
odpowiada zawartości 1 µg chromu; Glukonian żelaza (0,246) –
odpowiada zawartości 0,03 mg żelaza; Fluorek wapnia (97 µg)
– odpowiada zawartości 37 µg fluoru; Węglan magnezu (4,3) –
odpowiada zawartości 1 mg magnezu; Węglan manganu (0,23) –
odpowiada zawartości 0,1 mg manganu; Selenian sodu (2.2 µg)
– odpowiada zawartości 1 µg selenu; Tlenek cynku (0,54) –
odpowiada zawartości 0,375 mg cynku; Dekstroza, kakao,
sacharoza (do 740 mg). Żelatynowe kapsułki po 405 mg:
Garcinia cambogia (200); Camelia sinensis (70); Morszczyn
pęcherzykowaty (70); Witamina C (32); Drożdże z chromem (25)
– odpowiada zawartości 50 µg chromu. Żelatynowe kapsułki po
400mg: Dzięgiel chiński - Angelica sinensis (31); Orzech
wirginijski – Hamamelis virginiana (31); Mącznica lekarska –
Arctostaphylos uva-ursi (31); Witamina PP (18); Witamina B5
(6); Witamina B6 (1,65); Witamina B2 (1,6); Witamina B1
(1,15); Witamina B9 (0,2); Witamina B12 (1 µg); Witamina D3
(5 µg); Uwodniony fosforan wapnia (112,5) - odpowiada
zawartości 26 mg wapnia; Węglan magnezu (100) – odpowiada
zawartości 26 mg magnezu; Glukonian żelaza (55) – odpowiada
zawartości 7 mg żelaza. Żelatynowe kapsułki po 405 mg:
Melisa lekarska – Melissa officinalis (50); Lawenda
wąskolistna – Lavandula angustifolia (50); Mak polny –
Papaver rhoeas (50); Witamina PP (18); Witamina B5 (6);
Witamina B6 (1,65); Witamina B2 (1,6); Witamina B1 (1,15);
Witamina B9 (0,2); Witamina B12 (1 µg); Witamina D3 (5 µg);
Uwodniony fosforan wapnia (112,25) – odpowiada zawartości 26
mg wapnia; Węglan magnezu (100) – odpowiada zawartości 26 mg
magnezu.
Najczulszą metodą badania wolnych rodników jest elektronowy
rezonans paramagnetyczny (EPR). Ponieważ rodniki powstające
w organizmach żywych mają na ogół czas rzędu ułamków
sekundy, więc są trudne do bezpośredniego zarejestrowania. Z
tego powodu przetestowanie właściwości utleniających
badanych surowców "in vivo" jest niemożliwe. W1989 roku
Hatano i inni [4] zaproponowali testowanie zdolności
antyutleniajacych tanin w stosunku do trwałego rodnika
1,1-difenylo-2-pikrylo-hy-drazylu (DPPH). Zdolność
wymiatania rodnika określano poprzez porównanie
intensywności sygnałów wzorca DPPH (10) z sygnałem tego
rodnika po dodaniu badanego materiału (I). Za zdolność
wymiatania wolnych rodników przyjęto wielkość opisaną
następującym wzorem: Zgodnie z przyjętą konwencją im większa
wielkość Z, tym lepsza zdolność wymiatania wolnych rodników.
PRZYGOTOWANIE PRÓBEK I WZORCÓW
Przygotowanie roztworu rodnika DPPH
0,1 g DPHH (1,1-difenylo-2-pikrylohydrazydu) odważono do
kolby miarowej o pojemności 100cm3 i uzupełniono do kreski
acetonem. Stężenie wzorcowego roztworu wynosiło 0,0025
mol/dm3. Przygotowanie próbki
0,5 g każdego badanego materiału rozpuszczano w 50 ml wody
destylowanej w temperaturze pokojowej. W ten sposób
otrzymany roztwór w ilości 200 µl dodawano do 1 ml roztworu
trwałego rodnika DPPH.
Przygotowanie wzorca
Do 1 ml roztworu rodnika DPPH dodawano 200 µl wody
destylowanej. Roztwór wzorcowy i próbki umieszczano w
rurkach EPR (średnica wewnętrzna 4 mm) tak, aby wypełniały
ją szczelnie w całym obszarze wnęki rezonansowej
spektrometru.
APARATURA
Urządzenia do rejestrowania widm EPR nazywane są
magnetycznymi spektrometrami mikrofalowymi. W
elektronowym rezonansie paramagnetycznym widmo standartowe
uzyskuje się przez przemiatanie próbki zmiennym polem
magnetycznym przy stałej częstości promieniowania.
Stosuje się do tego celu promieniowanie mikrofalowe, co
odpowiada dla rodników organicznych wartościom pola w
zakresię 300 -400mT. Promieniowanie mikrofalowe generowane
jest przez klistron i doprowadzane do rezonatora falowodami.
Podstawowe części spektrometru EPR wykorzystywanego na
Wydziale Farmacji AM w Warszawie przedstawiono na fotografii
1. Pomiędzy biegunami silnego pola magnetycznego znajduje
się wnęka rezonansowa – w tym miejscu umieszczana jest
badana próbka lub wzorzec. Promieniowanie mikrofalowe
generowane przez klistron (częstotliwość 9,3 GHZ – pasmo X)
dociera falowodami do rezonatora i po przejściu przez próbkę
(lub wzorzec) trafia do detektora krzemowego, z którego
sygnał elektryczny, po wzmocnieniu, podawany jest na
rejestrator sprzężony z komputerem. Aby zwiększyć czułość, w
spektrometrach EPR stosowana jest modulacja dodatkowym
promieniowaniem (w naszym przypadku o częstotliwości 100 kHz).
Zastosowanie modulacji zmienia kształt widma absorpcji EPR,
które jest wówczas zapisywane w postaci pierwszej pochodnej
absorpcji w funkcji indukcji. W celu obliczenia integralnej
intensywności sygnału próbki (I) i wzorca (I0) należy zatem
stosować dwukrotne całkowanie widma. Przykładowe widmo
absorpcji EPR dla rodnika DPPH (wzorca) i rodnika DPPH po
dodaniu próbki Lifepack Antiox przedstawiono na Rys. 1.
Fotografia 1. Układ pomiarowy spektrometru EPR stosowany w
niniejszej pracy
Widma
EPR rodnika DPPH – wzorca (kolor czerwony) i rodnika DPPH
po dodaniu próbki Lifepack Antiox (kolor granatowy) |
